美研| CMC系列(十二)：单晶结构解析在药物开发中的应用和单晶培养哪些事儿

开篇引言

X射线衍射单晶结构解析作为一种可以精确测定分子三维空间结构的首选方法，是现代化学研究中重要的技术手段之一，广泛应用于化学、材料科学和生命科学等领域的研究。

1 单晶培养在药物开发中的应用

化合物的结构决定化合物的物理化学性质，只有充分了解化合物的结构，才能深入认识和理解化合物的性质，才能更好的指导我们药物的研究与开发。

探寻物质结构的方法有很多种，比如元素分析、紫外吸收光谱（UV）、红外吸收光谱（IR）、拉曼吸收光谱（Raman）、核磁共振谱（NMR）、高分辨质谱（HRMS）等，这些方法中，大部分都是基于物质对某些波长的电磁波的吸收或发射，这些均属于波谱方法。人们就可以从这种吸收谱推导出物质的结构与性质方面的信息。例如从核磁共振谱图可以得到化学位移和耦合常数，通过这些信息可以推导出碳、氢等原子的数量、原子之间的相互关系等等。

不同的波谱方法可以得到各种有用的信息，然而，这些方法都无法准确给出分子的立体结构信息。

单晶X-射线结构分析是当前认识固态物质微观结构的最有力的技术手段。随着医药行业的发展，每年都有大量的新化合物被合成出来，这些化合物中，有相当部分不仅结构新颖，而且结构也越来越大越来越复杂，用其它波谱方法难以比较清楚、全面地了解其空间结构。单晶结构分析可以提供一个化合物在固态中所有原子的精确空间位置，从而为化合物研究提供广泛而重要的信息，包括分子、原子的连接形式、分子构象、键长和键角等数据。另外，还可以从中得到化合物的组成比例，对称性、以及原子或分子在三维空间的排列、堆积方式。单晶结构分析是目前诸多固态物质结构分析方法中，可以提供信息最多、最常用的研究方法。

单晶结构解析在药物开发中的主要应用如下：

❖ 确证化合物的立体结构：CDE颁布的《手性药物质量控制研究技术指导原则》要求手性药物，需要选择合适的方式来证明该药物的绝对构型。药品审评中心在对该指导原则解读文章中指出，单晶X射线衍射法是确证手性药物构型（手性中心绝对构型）的首选方法，尤其在确证创新性药物构型时，或当药物中存在多个手性中心时，应尽可能通过各种办法获得该药物的单晶样品进行单晶X射线衍射测定；
❖ 确证化合物分子中双键顺反异构，环丁烷对位的顺反异构、轴手性、特殊官能团的互变异构等；
❖ 确定原子的位置和连接形式；
❖ 确定化合物的化学组成以及比例：盐型研究中，可以明确成盐的摩尔比，成盐位点，API和成盐反离子之间是键合方式如成盐还是成共晶。共晶筛选，亦是确证成共晶与否的主要技术手段等；
❖ 溶剂组成以及溶剂和API的结合方式：可以直接提供化合物是水合物还是某溶剂合物、溶剂的结合方式，是管道水合物还是隔离型水合物以及水的含量；
❖ 确定晶型的晶胞参数，提供晶型的标准XRPD谱图。

2 什么是好的晶体

晶体是内部一种原子、分子或离子在三维空间有规律地重复排列的固态物质。由于空间排列的规律性，可以把晶体中若干个原子、分子或离子抽象为一个点，于是晶体可以看成空间点阵。如果整块固体为一个空间点阵所贯穿，则称为单晶体，简称单晶。好的单晶应该透明有光泽，表面干净无裂痕（如下图1），应该满足以下基本条件：

❖ 内部结构高度有序、不存在晶格缺陷；
❖ 大小能够满足测试要求（有机物通常为0.1-0.3 mm）；
❖ 并不一定要形状规则，但表面需要光滑无裂纹；
❖ 不聚集或者少聚集，没有明显的杂质以及不会出现多个单晶重叠在一块；
❖ 不容易风化，具有一定的稳定性。

图1. 不同晶习的单晶

3 单晶培养方法

只有培养出好的单晶，才能获得理想的单晶X-射线衍射数据，而理想的单晶X射线衍射数据是结构解析的前提。常用的单晶生长方法有溶剂缓慢挥发法、冷却结晶法、界面扩散法、气液扩散法等，如图2所示。常用的单晶培养方法和注意事项，已经有大量的文献报道，这里不作详细介绍，接下来主要就两种新技术熔体微滴法和共结晶法做阐述。

图2. 单晶的培养方法

A、熔体微滴法培养单晶：

将样品部分熔融至剩余单颗粒，降温至 0.97–0.99Tm ，使得该单颗粒在熔融微滴中生长，该方法的高温可避免二次成核和其他晶型的干扰。

图3. 熔体微滴生长单晶

B、共结晶法：

许多化合物不容易结晶，容易产生油、胶状物、无定型等，当使用常规方法无法获得单晶，或者目标化合物难于结晶，解决小分子化合物结晶问题的另外一种选择是用较大的有机主体生产包合物。比如四芳基金刚烷（TAAS）很容易与小分子形成结晶包合物，用TDA或TBro进行热结晶实验。分析物和金刚烷的混合物在实验室加热板上加热最多30秒，直到形成澄清的溶液，然后关闭加热板，使溶液冷却到室温，晶体在几分钟或几小时内形成。

图4. 四芳基金刚烷结构

图5. 通过与TDA和TBro共结晶获得X晶体结构的化合物

4 云顶yd222线路检测药物固态开发技术平台

云顶yd222线路检测药物固态开发技术平台具有专业和经验丰富的盐型/共晶筛选、晶型筛选、单晶培养和结构解析、晶型定性定量研究团队。目前累计完成单晶培养50个，成功培养出单晶超过40个，成功率达到80%以上，研究结果满足药物注册申报研究要求，同时积极配合客户完成审计及药监部门的现场核查工作。

5 云顶yd222线路检测案例分享

案例一 确定具有轴手性化合物的立体结构

项目背景：

1、化合物具有轴手性；
2、容易形成片状晶体并团聚；
3、培养出适合的单晶后进行结构解析；
4、确定构型，交付单晶结构解析报告。

案例二 确定水合物的结合方式以及水的比列

项目背景：

1、某新药API是水合物，但水的含量通过TGA和KF不好明确，客户认为化合物是一水合物，项目组更趋向是半水合物；
2、通过单晶结构解析了解水的结合方式以及比列；
3、培养单晶，通过单晶结构解析确定了该水合物是半水合物，水分子处在晶体的隧道中，通过氢键连接。

参考文献：

[1] 陈小明，蔡继文.单晶结构分析原理与实践第2版[M].北京：科学出版社，2007.
[2] 手性药物质量控制研究技术指导原则.
[3] 指导原则解读系列专题（十四）-手性药物的合成工艺及结构确证.
[4] Ou X, Li X, Rong H, et al. A general method for cultivating single crystals from melt microdroplets[J]. Chemical Communications, 2020, 56, 9950-9953.
[5] Absolute Configuration of Small Molecules by Co-Crystallization Felix Krupp, Wolfgang Frey, Clemens RichertAngew. Chem. Int. Ed.,2020, DOI: 10.1002/anie.202004992.

美研|CMC系列回顾

❖ CMC系列(一)|浅谈药物研发中原料药工艺研究的重要性

❖ CMC系列(二)|药学研究之世界银屑病日

❖ CMC系列(三)|高端吸入药物的市场格局和研究现状

❖ CMC系列(四)|浅谈手性药物的研究策略

❖ CMC系列(五)|药物晶型控制策略

❖ CMC系列(六)|含氮类化合物-可挥发碱性有机胺的气相分析

❖ CMC系列(七)|新药研究中的固态开发挑战及应对策略

❖ CMC系列(八)|浅析ICH指导原则Q3C及未收录残留溶剂限度制定方法

❖ CMC系列(九)|定量核磁应用及其方法验证/定量核磁那些事儿

❖ CMC系列(十)|药物杂质研究策略之基因毒性杂质

❖ CMC系列(十一)|手性化合物的拆分策略与经验分享